色譜分析的重要作用之一是對樣品定量。而色譜法定量的依據(jù)是：組分的重量或在載氣中的濃度與檢測器的響應(yīng)信號成正比。常見定量分析方法分為面積歸一化法、內(nèi)標法、外標法等。大家常常容易傻傻分不清楚的莫過于內(nèi)標法、外標法了。
以內(nèi)標法為例，選一與欲測組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標物（當然是樣品中沒有的組分），然后配制欲測組分和內(nèi)標物的混合標準溶液，進樣得相對校正因子。再將內(nèi)標物加入欲測組分的樣品中，進樣后測得欲測組分和內(nèi)標物的定量參數(shù)，用內(nèi)標法公式計算即可。其實，從定義上來區(qū)分的話，外標法就是用標準品的峰面積或峰高與其對應(yīng)的濃度做一條標準曲線，測出樣品的峰面積或峰高，在標準曲線上查出其對應(yīng)的濃度，這是最常用的一種定量方法；內(nèi)標法是對應(yīng)外標法說的，內(nèi)標法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標物，加入到準確稱量的試樣中，根據(jù)被測試樣和內(nèi)標物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色譜峰面積之比，來計算被測組分的含量。外標法需要用樣品和標準品對比，但是有時我們很難保證樣品和標準品進的體積是一樣的，畢竟要有誤差，這時候就用內(nèi)標法，就是在外標法的基礎(chǔ)上，在樣品和標準品里在加入一種物質(zhì)，通過加入物質(zhì)的峰面積或峰高的變化，就可以看出我們標準品和樣品進樣體積的差別，但同時會引進加入物質(zhì)的秤量誤差。所以一般用外標法來定量，如果進樣體積很難掌握，就用內(nèi)標法，可以消除進樣體積的誤差。
首先用欲測組分的標準樣品繪制標準工作曲線。具體作法是：用標準樣品配制成不同濃度的標準系列，在與欲測組分相同的色譜條件下，等體積準確量進樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標準工作曲線，此標準工作曲線應(yīng)是通過原點的直線。若標準工作曲線不通過原點，說明測定方法存在系統(tǒng)誤差。標準工作曲線的斜率即為絕對校正因子。
當欲測組分含量變化不大，并已知這一組分的大概含量時，也可以不必繪制標準工作曲線，而用單點校正法，即直接比較法定量。單點校正法實際上是利用原點作為標準工作曲線上的另一個點。因此，當方法存在系統(tǒng)誤差時（即標準工作曲線不通過原點），單點校正法的誤差較大。因此規(guī)定，y=ax+b， b的絕對值應(yīng)不大于100%響應(yīng)值是y的2%。標準曲線法的優(yōu)點：繪制好標準工作曲線后測定工作就很簡單了，計算時可直接從標準工作曲線上讀出含量，這對大量樣品分析十分合適。特別是標準工作曲線繪制后可以使用一段時間，在此段時間內(nèi)可經(jīng)常用一個標準樣品對標準工作曲線進行單點校正，以確定該標準工作曲線是否還可使用。標準曲線法的缺點：每次樣品分析的色譜條件（檢測器的響應(yīng)性能，柱溫度，流動相流速及組成，進樣量，柱效等）很難完全相同，因此容易出現(xiàn)較大誤差。另外，標準工作曲線繪制時，一般使用欲測組分的標準樣品（或已知準確含量的樣品），因此對樣品前處理過程中欲測組分的變化無法進行補償。
選擇適宜的物質(zhì)作為欲測組分的參比物，定量加到樣品中去，依據(jù)欲測組分和參比物在檢測器上的響應(yīng)值（峰面積或峰高）之比和參比物加入的量進行定量分析的方法稱為內(nèi)標法。
內(nèi)標法的關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標物。內(nèi)標物應(yīng)是原樣品中不存在的純物質(zhì)，該物質(zhì)的性質(zhì)應(yīng)盡可能與欲測組分相近，不與被測樣品起化學(xué)反應(yīng)，同時要能完全溶于被測樣品中。內(nèi)標物的峰應(yīng)盡可能接近欲測組分的峰，或位于幾個欲測組分的峰中間，但必須與樣品中的所有峰不重疊，即完全分開。內(nèi)標法的優(yōu)點：進樣量的變化，色譜條件的微小變化對內(nèi)標法定量結(jié)果的影響不大，特別是在樣品前處理（如濃縮、萃取，衍生化等）前加入內(nèi)標物，然后再進行前處理時，可部分補償欲測組分在樣品前處理時的損失。若要獲得很高精度的結(jié)果時，可以加入數(shù)種內(nèi)標物，以提高定量分析的精度。內(nèi)標法的缺點：選擇合適的內(nèi)標物比較困難，內(nèi)標物的稱量要準確，操作較麻煩。使用內(nèi)標法定量時要測量欲測組分和內(nèi)標物的兩個峰的峰面積（或峰高），根據(jù)誤差疊加原理，內(nèi)標法定量的誤差中，由于峰面積測量引起的誤差是標準曲線法定量的2-2是由于進樣量的變化和色譜條件變化引起的誤差，內(nèi)標法比標準曲線法要小很多，所以總的來說，內(nèi)標法定量比標準曲線法定量的準確度和精密度都要好。
標準加入法實質(zhì)上是一種特殊的內(nèi)標法，是在選擇不到合適的內(nèi)標物時，以欲測組分的純物質(zhì)為內(nèi)標物，加入到待測樣品中，然后在相同的色譜條件下，測定加入欲測組分純物質(zhì)前后欲測組分的峰面積（或峰高），從而計算欲測組分在樣品中的含量的方法。
標準加入法的優(yōu)點：不需要另外的標準物質(zhì)作內(nèi)標物，只需欲測組分的純物質(zhì)，進樣量不必十分準確，操作簡單。若在樣品的前處理之前就加入已知準確量的欲測組分，則可以完全補償欲測組分在前處理過程中的損失，是色譜分析中較常用的定量分析方法。標準加入法的缺點：要求加入欲測組分前后兩次色譜測定的色譜條件完全相同，以保證兩次測定時的校正因子子完全相等，否則將引起分析測定的誤差。1、內(nèi)標物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì)；2、它必須完全溶于試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離；3、加入內(nèi)標物的量應(yīng)接近于被測組分；4、色譜峰的位置應(yīng)與被測組分的色譜峰的位置相近，或在幾個被測組分色譜峰中間。內(nèi)標法的優(yōu)點是測定的結(jié)果較為準確，由于通過測量內(nèi)標物及被測組分的峰面積的相對值來進行計算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。內(nèi)標法的缺點是操作程序較為麻煩，每次分析時內(nèi)標物和試樣都要準確稱量，有時尋找合適的內(nèi)標物也有困難。外標法簡便，但進樣量要求十分準確，要嚴格控制在與標準物相同的操作條件下進行，否則造成分析誤差，得不到準確的測量結(jié)果。內(nèi)標與外標都是定量的一種方法而已，至于哪一種方法好與不好不能一概而論，做不同的分析，面對著不同的要求，再加上分析成本分析效率等等問題，我想簡單而有效進行定量分析來滿足要求才是最重要的。
在許多應(yīng)用中，內(nèi)標應(yīng)盡可能早地添加到分析過程中，例如用于校正樣品制備過程中的損失。但在某些應(yīng)用中，可能需要在稍后階段添加內(nèi)標。例如，對于有消解階段的方法，如果所選的內(nèi)標是消解后目標化合物的類似物，那么在消解階段之后添加可能是最合適的。選擇非同位素標記的內(nèi)標時應(yīng)考慮以下幾個方面：
任何要分析的樣品中都不應(yīng)該含有這種物質(zhì)。例如，使用處方藥作為治療藥物監(jiān)測（TDM) 應(yīng)用的內(nèi)標就不是一個好主意。
內(nèi)標物的理化性質(zhì)應(yīng)盡可能與目標分析物相似，洗脫時間應(yīng)盡可能接近目標分析物。
同分異構(gòu)體、同源物和結(jié)構(gòu)類似物通常是理想的候選物質(zhì)。
▲ 圖1. 內(nèi)標使用示意圖【來源：Probing Protein Glycation by Chromatography and Mass Spectrometry: Analysis of Glycation Adducts】
同位素內(nèi)標的使用
如果有同位素標記的內(nèi)標，則應(yīng)在分析開始時添加，以用于計算一些方法變量，包括：
轉(zhuǎn)移和凈化階段的損失。
提取效率的變化。
進樣量的變化。
基質(zhì)抑制/增強。
樣品和校準品之間響應(yīng)的變化
在使用同位素標記的內(nèi)標時需要謹慎。如果有多種同位素可供選擇，在 LC-MS 應(yīng)用中，13C 和 15N 標記的化合物通常比氘（2H）標記的化合物更受歡迎。這是因為與 13C 和 15N 內(nèi)標相比，氘標記化合物的色譜保留時間與天然化合物的色譜保留時間有較大偏移。在液相色譜應(yīng)用中，與高效氣相色譜分離相比，這種保留時間的偏移通常很小，但目標化合物和內(nèi)標在基質(zhì)抑制（和增強）方面仍有可能存在細微差別，進而影響測量的峰面積。
在選擇同位素標記的內(nèi)標時，還應(yīng)考慮以下幾點：
標記應(yīng)在分子的穩(wěn)定部分，標記程度不應(yīng)因分析過程中發(fā)生的反向交換而改變。可能會發(fā)生意想不到的交換，例如通過同分異構(gòu)機制發(fā)生的交換，因此在實驗中應(yīng)始終對這方面進行檢查。
目標分析物和內(nèi)標之間不應(yīng)有任何明顯的質(zhì)譜重疊。因此，在大多數(shù)小分子應(yīng)用中，內(nèi)標的單同位素質(zhì)量最好至少比天然化合物高 3 Da。
還應(yīng)避免同位素峰中含有大量未標記物質(zhì)。內(nèi)標的總體純度并不重要，只要其雜質(zhì)不影響分析方法中的任何目標化合物即可。
在 IDMS 方法中，內(nèi)標和目標物的完全平衡對確保準確性至關(guān)重要�？赡苄枰M行平衡和萃取研究，以證明目標物已被完全萃取/釋放而未發(fā)生降解，或者內(nèi)標已與樣品平衡，并與基質(zhì)成分和/或活性表面結(jié)合到與目標物相同的程度。
若在儀器上使用內(nèi)標法進行定量，則橫坐標為：目標物濃度與內(nèi)標濃度的比值；縱坐標為目標物峰面積與內(nèi)標峰面積的比值（外標法的橫坐標為目標物濃度，縱坐標為目標物峰面積）。
以前做過很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒有自動進樣器，用外標法定量，確實重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差，結(jié)果經(jīng)常受到搞合成同事的質(zhì)疑。其實，仔細分析原因不一定就是外標法不適合這種定量分析，首先我們的實驗室儀器和手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了，比如，襯管是否潔凈，玻璃棉的位置是否合適恰當（能否使樣品盡可能的汽化）、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否對稱（也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配）、附近有沒有其它色譜峰的干擾、選用什么進樣方式（如快速進樣還是熱針進樣）等等因素的影響都需要考慮，如果這些因素都考慮了，按照GMP方法驗證對于精密度的要求，同一樣品進6針以上的RSD和配制6個樣品的定量結(jié)果RSD都能滿足小于1.5%的要求，那么這個方法用外標法就是完全適用的，但是前面的影響因素是一定要都考慮到的，否則談?wù)撨@個方法是否適用就有失偏頗了。在做過的許多出口產(chǎn)品的定量分析方法當中有許多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗證過的方法，內(nèi)標與外標都有（他們用的都是自動進樣）精密度都能滿足RSD小于1.5%的要求，當一個方法能夠滿足測試要求的時候，無論內(nèi)標外標，都是可行的，當然有一個分析成本和分析時間的問題，內(nèi)標的成本和控制溶液、樣品溶液的配制當然要比外標要高和麻煩一些了。而有些時候，可能受你實驗室現(xiàn)有儀器和附屬設(shè)備的影響，達不到一定的要求，而還必須進行定量分析，有時外標的結(jié)果可能就要差一些，這時，你可能就要考慮用內(nèi)標法了，可以排除手動進樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響，這時內(nèi)標可能就顯示出它的優(yōu)勢來了。上面已經(jīng)提到當做方法驗證的時候，當同一樣品配制6個樣品溶液用所選用的外標法進行定量的時候，RSD都滿足1.5%的要求時，也分為兩種情況，小于1%和大于1%小于1.5%。如果RSD的結(jié)果小于1%，那這個方法就沒有什么可以懷疑的了；如果RSD的結(jié)果大于1%而在1.5%略低一些的范圍活動時，這個方法的可行性就將受到質(zhì)疑，畢竟這是方法驗證，你就要考慮上面1所提到的影響因素的影響了，如果排除掉以上的影響因素，RSD還是在1.5%附近，就要嘗試內(nèi)標了，如果內(nèi)標結(jié)果的RSD很好，就證明你的這個方法受實驗條件的影響很大，只能用內(nèi)標了，或者干脆將原方法做大的變動，再嘗試用外標法測試。而對于微量分析，比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等，根據(jù)不同的限量標準要求對于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多，RSD有時可以允許達到10%甚至更高，這時可能外標法有更大的應(yīng)用空間。單從精密度方面去考慮，排除其它成本和效率的因素，個人認為還是內(nèi)標優(yōu)于外標。曾經(jīng)做過一個中間體二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺為內(nèi)標，RTX-5amine（堿改性）15m*0.32mm*1.0um色譜柱分析，將配制好的控制溶液（含有內(nèi)標物）自動進樣器進6針，目的物（二氨基丙醇）與內(nèi)標物（二乙醇胺）峰面積比率的RSD為0.18%，而只對這六針樣品的目的物峰（二氨基丙醇）面積求RSD，結(jié)果為0.71%，通過這一實例的結(jié)果大家就會發(fā)現(xiàn)到底哪個方法精密度更好了，當然是內(nèi)標更好了。當然這個化合物的檢測方法最后根據(jù)上面的驗證數(shù)據(jù)用內(nèi)標和外標定量都是可以的，實驗室可以自由選擇。但內(nèi)標與外標精密度結(jié)果的差異是顯然存在的事實。綜上所述，如果應(yīng)用外標法能夠滿足要求的話，當然首選還是外標法，畢竟簡單而省事。對于精密度要求比較高、結(jié)果準確度會產(chǎn)生重大影響、實驗室條件不是很理想的等等條件下，用內(nèi)標法還是必要的。但無論應(yīng)用那種方法，方法的驗證和確認都是很重要的，只要是按照程序經(jīng)過驗證和確認的方法，都有其應(yīng)用的空間的。個人觀點，供大家參考。
